【求助】Ni柱纯化问题

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收集细胞后，超声破碎。在上清里加0.2%的Tween20后上柱。然后用pH6.0buffer洗至OD280<0.01,再分别用20mM，40mM咪唑洗，用100、200、300mM洗脱。
问题：
有时候目的蛋白会在20或者40的时候被大量洗脱下来，再将上清上柱两次或者降低流速后这种问题会解决，但是在40－100的咪唑里没有什么蛋白被洗下来，而到了200、30 ...

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